美西螈（Ambystoma mexicanum, 也稱鈍口螈，六角恐龍）和其他的蠑螈是唯一能夠再生全肢的四足動物。在這個復雜的過程中，基因表達的變化調(diào)節(jié)著新的附屬肢體長出，但是人們對損傷如何誘導肢體細胞形成能夠分化為多種細胞類型的再生性祖細胞知之甚少。在肢體再生過程中，對單個細胞進行追蹤和分子分析將會鑒定出不同的分化途徑，并為細胞如何從成熟的靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵偕约毎V系提供線索。

美西螈的肢體由許多不同的細胞類型組成，這些細胞類型源自神經(jīng)細胞譜系、肌源性細胞譜系、表皮細胞譜系和結(jié)締組織（connective tissue, CT）細胞譜系。肢體截肢后，來自截肢平面附近的細胞聚集在一個稱為芽基（blastema）的獨特組織中，芽基起著作為再生新肢體的祖細胞來源的作用。

在一種轉(zhuǎn)基因美西螈品系中，不同的成體細胞類型的后代能夠在再生過程中被標記、追蹤和分離出來，這就為理解特定的細胞譜系在芽基形成和隨后的肢體再生期間是如何發(fā)育的提供了機會。將轉(zhuǎn)基因美西螈品系與單細胞RNA測序（scRNA-seq）相結(jié)合能夠追蹤單個細胞類型，以及重建這些特定的細胞譜系的再生過程背后的分子步驟。

作為側(cè)板中胚層（lateral plate mesoderm）的后代，CT細胞是最為豐富的細胞譜系，有助于促進芽基產(chǎn)生，并且包圍著骨骼和軟骨、肌腱、骨骼外周（periskeleton）以及真皮成纖維細胞和間質(zhì)成纖維細胞。這些細胞檢測截肢部位所在的位置，導致適當?shù)闹w部分再生，從而使得CT細胞成為破譯和理解再生分子程序的關(guān)鍵細胞譜系。

在一項新的研究中，德國研究人員采用一種誘導型Cre-loxP熒光系統(tǒng)建立遺傳標記的轉(zhuǎn)基因美西螈品系用于分離成體肢體組織中的CT細胞和芽基中的CT細胞后代。他們利用scRNA-seq沿著芽基形成和再生胳膊長出的密集時間過程以及胚胎肢體的發(fā)育階段對CT細胞進行分子分析。這種分子分析表明CT細胞表達一進入誘導再生時就失去的成體表型。這種源自CT細胞的異質(zhì)細胞群體會聚到一種均勻而又短暫的芽基祖細胞狀態(tài)，這種狀態(tài)在后面的階段能夠重現(xiàn)胚胎肢體出芽樣程序。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2018年10月26日的Science期刊上，論文標題為“Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration”。

值得注意的是，這些研究人員并沒有在成熟的胳膊中發(fā)現(xiàn)CT干細胞或芽基樣前體細胞存在的證據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)CT細胞亞型對再生胳膊中的近端隔室和遠端隔室作出空間限制的貢獻。具體而言，一種特定的CT細胞亞型---骨骼外周細胞（periskeletal cell）---在截肢部位延伸切斷的骨骼，然而成纖維細胞性的CT細胞從頭再生遠端的骨骼節(jié)段。

通過使用高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析和一種基于美西螈的腦彩虹克隆譜系追蹤技術(shù)，這些研究人員能夠在再生的最后階段追蹤CT細胞譜系的再分化軌跡。

這些發(fā)現(xiàn)確立了多能骨骼祖細胞（multipotent skeletal progenitor cell）的形成，而這些多能骨骼祖細胞導致肌腱、韌帶、骨骼、骨骼外周和成纖維細胞產(chǎn)生。

綜上所述，CT細胞是理解肢體再生的關(guān)鍵細胞類型，這是因為它們形成圖案化的肢體骨骼，從而指導其他肢體組織（比如肌肉）的再生。鑒于CT細胞的異質(zhì)性以及與其他細胞類型混合在一起，人們通常很難研究CT細胞如何形成再生性芽基細胞。對這些新培育出的轉(zhuǎn)基因美西螈報告品系的使用，再結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析和克隆追蹤，允許這些研究人員確定出當具有不同分子特征的CT細胞去分化為一種常見的類似于胚胎肢芽細胞的多能祖細胞時，它們經(jīng)歷一種獨特的分子狀態(tài)。

在未來，測試這種過渡狀態(tài)中的哪些組分是這種去分化過程所必需的將是比較重要的。此外，這項研究為探究再生相關(guān)基因及其相關(guān)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在這種過渡過程中如何受到調(diào)節(jié)提供了可能性。最后，這項研究也提供了這樣的一種可能性：在哺乳動物動物中觀察到的有限再生能力是由于無法將CT細胞重編程到這樣的胚胎狀態(tài)。

參考資料：Tobias Gerber1,*, Prayag Murawala2,3,*,†,‡, Dunja Knapp et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science, 26 October 2018, 362(6413):eaaq0681, doi:10.1126/science.aaq0681.

原標題：Science：利用單細胞分析揭示蠑螈再生肢體機制