文 | 劉磊

21世紀(jì)是生物科學(xué)與生物技術(shù)的世紀(jì)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)、反義核酸技術(shù)、RNAi技術(shù)等基因操作方法的發(fā)展與完善，采用分子生物學(xué)手段治療遺傳疾病、腫瘤、心血管和代謝性疾病等已成為本世紀(jì)的一大熱點領(lǐng)域。從1990年美國FDA批準(zhǔn)第1項人類基因治療的臨床試驗方案至今，基因治療的研究已經(jīng)走過了接近30年的歷程，其研究迅速發(fā)展,已取得很多突破。作為一項跨世紀(jì)工程，其受到科學(xué)界越來越多的關(guān)注，目前已有少數(shù)有確切療效的臨床試驗。

1、前 言

早在45年前，基因治療先驅(qū)西奧多·弗里德曼（Theodore Friedmann）就提出單基因遺傳病可通過給病人提供正確的基因來治療[1]。從原理上來說，基于蛋白的療法需要反復(fù)給藥（例如糖尿病人需要一直注射胰島素），而如果可修復(fù)病人的錯誤基因或直接提供正確的基因，那么單次治療就有可能產(chǎn)生持續(xù)的治療效果。

基因療法的發(fā)展之路漫長而曲折，在早期臨床研究中遇到的嚴(yán)重不良反應(yīng)，促使基因治療研究轉(zhuǎn)向更安全、更有效的基因轉(zhuǎn)移載體。經(jīng)過三十年探索，通過修改DNA來治療疾病的基因治療方法不再是未來醫(yī)學(xué)，而是當(dāng)今臨床治療工具的一部分，正在為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來多個新的治療選擇。

2、什么是基因治療

基因治療是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。糾正的途徑既可以是原位修復(fù)有缺陷的基因，也可以是用有功能的正?；蜣D(zhuǎn)入細(xì)胞基因組的某一部位，以替代缺陷基因來發(fā)揮作用。將外源的基因?qū)肷锛?xì)胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法或載體。腺病毒載體是目前基因治療最為常用的病毒載體之一?；蛑委熤饕侵委熌切θ祟惤】低{嚴(yán)重的疾病，包括：遺傳?。ㄈ缪巡?、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾?。ㄈ绨滩?、類風(fēng)濕等）。

3、基因治療發(fā)展史

基因治療概念的形成有著非常悠久的歷史，最早可以追溯到1963年，剛好是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)表10年，獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎1年之后，美國分子生物學(xué)家、諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者喬舒亞·萊德伯格（JoshuaLederberg）提出了基因交換和基因優(yōu)化的理念。20世紀(jì)七八十年代，限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶等相繼被發(fā)現(xiàn)，基因重組工程技術(shù)得到發(fā)展，病毒載體出現(xiàn)，基因治療的技術(shù)體系初步具備。1972年，美國著名生物學(xué)家西奧多·弗里德曼（Theodore Friedmann）等人在《Science》雜志上發(fā)表了一篇被廣泛認(rèn)為具有劃時代意義的前瞻性評論《基因治療能否用于人類遺傳??？》，提出了基因治療是否可以用于人類疾病治療的設(shè)問。

隨著基因體外擴(kuò)增，尤其是PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的出現(xiàn)和完善，基因克隆技術(shù)日臻成熟，DNA重組技術(shù)和病毒載體也得到進(jìn)一步發(fā)展，分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)開始進(jìn)入黃金時期。截至1990年，來自多個研究組的一系列工作令人信服地驗證了病毒介導(dǎo)的基因糾正和替代的可行性與有效性。

歷史上首例基因療法的臨床試驗是由NIH的威廉·弗倫奇·安德森（William French Anderson）醫(yī)生領(lǐng)銜的針對重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID）的基因治療。安德森和合作者們首先從4歲女孩阿莎提·德席爾瓦（Ashanti DeSilva）體內(nèi)抽取白細(xì)胞，然后在體外利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將能夠正確編碼腺苷脫氨酶的ada基因插入到德席爾瓦的白細(xì)胞基因組中，最后將這些基因工程改造后的白細(xì)胞重新輸回德席爾瓦體內(nèi)，這一案例在基因治療發(fā)展史上無疑是一個極其重要的里程碑。

然而，在基因治療臨床試驗的早期，發(fā)生過沒有療效或產(chǎn)生意外的毒性導(dǎo)致某些病例死亡案例，導(dǎo)致基因治療進(jìn)入寒冬[2]。1996，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）咨詢小組得出結(jié)論，這些令人失望的臨床結(jié)果是由于對病毒載體、靶細(xì)胞和組織以及疾病的認(rèn)識不足造成的。咨詢小組建議研究人員重返實驗室，關(guān)注基因治療方法的基礎(chǔ)科學(xué)研究[3]。新載體的開發(fā)和對靶細(xì)胞的進(jìn)一步了解，引發(fā)了20世紀(jì)90年代末和21世紀(jì)初的第二代臨床試驗。這些試驗證明，在某些情況下，靶組織持續(xù)的基因修飾可以獲得臨床獲益。然而，由于基因轉(zhuǎn)移效率高導(dǎo)致的嚴(yán)重毒性，使基因治療的進(jìn)步再次放緩；例如：插入基因毒性，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的免疫破壞，某些載體相關(guān)的免疫反應(yīng)[2,4,5]。

在過去的10年中，基因治療在“科學(xué)”研究、安全性的改進(jìn)，基因轉(zhuǎn)移效率和輸注的進(jìn)一步成熟，最終推動了大量的臨床進(jìn)展。美國和世界各地的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，已經(jīng)批準(zhǔn)一些基因和基因修飾的細(xì)胞療法成為藥物，還有十多項獲得了“突破療法”稱號。基因治療目前的研究方向主要集中在基因傳遞載體、基因編輯以及CAR療法等。

4、基因傳遞載體

基因治療這項生物醫(yī)學(xué)技術(shù)要求將目的基因運輸?shù)桨屑?xì)胞，進(jìn)而將目的基因運輸?shù)郊?xì)胞核部位。因此，基因治療的關(guān)鍵技術(shù)是基因傳遞載體的設(shè)計?；蛑委熤谐Ｓ玫妮d體有病毒載體和非病毒載體，病毒載體主要包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等；非病毒載體主要是納米載體和高分子載體。

腺病毒載體 Adenovirus vector

腺病毒載體是目前臨床基因治療中使用最多的載體，占所有使用的基因治療載體24％。腺病毒載體在基因治療中的優(yōu)點有：方便——可以多種途徑給入，如肌注、靜注、口服和霧化吸人；安全性好。經(jīng)臨床及實驗研究證實，常用的5型腺病毒無致病及致癌作用，不會引起癌基因激活。宿主范圍廣。

然而，它缺乏特異靶向性，在一些缺乏其相應(yīng)受體的細(xì)胞中感染效率低。現(xiàn)在很多實驗室在構(gòu)建靶向腺病毒載體，它們主要針對腺病毒天然噬性進(jìn)行改造，從而只對特異性受體具有靶向性[6]。在體內(nèi)應(yīng)用時產(chǎn)生的免疫反應(yīng)也限制了它的應(yīng)用，空殼載體刪除了病毒基因組，只保留了ITRs及包裝信號，也稱為裸腺病毒載體，是第3代腺病毒載體，以第三代腺病毒為載體在進(jìn)行基因治療中具有重要意義[7]。

逆轉(zhuǎn)錄載體 Retroviral vectors

逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)是一類已知的RNA病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體最大優(yōu)點是：轉(zhuǎn)染譜廣，可以感染各種細(xì)胞類型；轉(zhuǎn)入的外源基因可完全整合；對細(xì)胞感染率高，達(dá)到100％；感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。根據(jù)報道利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體來進(jìn)行血友病A的基因治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展[8]。

二十世紀(jì)80年和90年代早期，證明開發(fā)的g型-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將基因?qū)朐偕脑煅杉?xì)胞。C型-逆轉(zhuǎn)錄病毒可以將有效的基因?qū)朐糡淋巴細(xì)胞。第一代的臨床試驗設(shè)計使用這些載體，轉(zhuǎn)移一個特定的缺陷基因進(jìn)入免疫缺陷病或癌癥患者的T細(xì)胞或造血干細(xì)胞的基因組[9]。

造血干細(xì)胞基因治療歷史如（圖1）所示。其中，γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(一般由小鼠白血病病毒MLV改造而來)是最早被改造的且最廣泛地被應(yīng)用到基因治療當(dāng)中。

慢病毒是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的成員之一，它的特點是可以感染分裂期和靜止期細(xì)胞。而且與其他載體相比，慢病毒載體的免疫原性比較低。同樣，它也可以整合基因至宿主細(xì)胞中使其長期穩(wěn)定表達(dá)。因此，慢病毒在基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。

來源：Science

其他病毒載體

除上述常用的病毒載體外，應(yīng)用于基因治療的載體還包括腺相關(guān)病毒，單純皰疹病毒，痘病毒和溶瘤病毒。其中腺相關(guān)病毒最常用于眼部疾病的基因治療，如遺傳性視網(wǎng)膜退行性病變。腺相關(guān)病毒(AAV)載體作為基因轉(zhuǎn)移載體具有安全性好、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率高、目的基因長期表達(dá)等優(yōu)勢，是視網(wǎng)膜色素變性基因治療領(lǐng)域最具潛力和應(yīng)用價值的病毒載體[6]。AAV載體來自于一種非致病性，無包膜的細(xì)小病毒，天然具有復(fù)制缺陷。AAV載體的一個限制是，不能容納超過5 kb的DNA（g-retroviral或慢病毒載體，可容納>8 kb DNA）。AAV載體主要是非整合性型；轉(zhuǎn)移的DNA作為游離基因是穩(wěn)定。這一特點降低了整合風(fēng)險，也限制了腺相關(guān)病毒載體在有絲分裂后細(xì)胞內(nèi)的長期表達(dá)。

非病毒載體

非病毒載體具有成本低、制備簡單、便于大規(guī)模生產(chǎn)、安全性高、外源基因長度不受限制等優(yōu)點。最簡單的非病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是裸DNA，可直接注入特定的組織，特別是肌肉，造成較高水平的基因表達(dá)。目前，正在研究的非病毒載體還有聚合物(聚-L一賴氨酸、聚乙烯亞胺等)、復(fù)合載體以及納米粒子載體等。

基因組編輯

與病毒載體僅可以介導(dǎo)一種基因修飾（“基因添加”）不同，新的基因組編輯技術(shù)可以介導(dǎo)基因添加、基因刪除、基因校正，以及細(xì)胞內(nèi)其他高度靶向的基因組修飾?；蚪M編輯可以在體外細(xì)胞上進(jìn)行，也可以在體內(nèi)進(jìn)行原位基因組編輯。靶向DNA替代是由一個核酸酶誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂引發(fā)（DSB），可以激活哺乳動物細(xì)胞中的高效重組。非同源末端連接（NHEJ）–介導(dǎo)的修復(fù)，可以在DSB位點有效的產(chǎn)生不同長度的插入片段或刪除突變（InDel），通常導(dǎo)致基因功能失活。同源定向修復(fù)（HDR），在同源供體DNA模板的存在下產(chǎn)生特定的替代序列，重組后在特定位點糾正突變或插入新序列。

早期的基因組編輯研究，依賴于特定的鋅指核酸酶（ZFN）[10]或超級核酸酶[11]，在DNA靶位點誘導(dǎo)所需的DNA雙鏈斷裂（DSBs）。這些核酸酶平臺需要專門的知識，定制特異的結(jié)合核酸酶效應(yīng)蛋白切割靶DNA，這限制了鋅指核酸酶的廣泛應(yīng)用。2009年證實，細(xì)菌蛋白的DNA結(jié)合區(qū)稱為轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)區(qū)（TALEs）很容易改變，為產(chǎn)生TALE核酸酶（TALENs）打開創(chuàng)造之門[12,13]。這些酶能有效地切割任何感興趣的DNA序列。然而，TALEN的方法仍然需要為每個新的靶向DNA設(shè)計兩條特定的核酸酶。

2012年，基因組編輯發(fā)生巨大的改變，Doudna和Charpentier開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌防御系統(tǒng)由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR）–CRISPR 相關(guān)核酸酶9（cas9），CRISPR- Cas9核酸酶可以有效地、程序性切割DNA位點，只需設(shè)計一條與感興趣的目標(biāo)位點互補(bǔ)的、特定的、短鏈指導(dǎo)RNA（gRNA）。CRISPR-Cas9核酸酶技術(shù)迅速擴(kuò)展到哺乳動物細(xì)胞，從而簡化基因組編輯過程。TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶，可以很容易地重編程切割特定的DNA序列，現(xiàn)在廣泛用于無數(shù)的基礎(chǔ)研究中[14-16]。

基因組編輯方法為糾正或改變基因組提供了一個精確的手術(shù)刀，可以克服依賴于病毒載體介導(dǎo)的半隨機(jī)基因組插入策略的許多缺點。

基因組編輯作為一種治療手段正在迅速發(fā)展到臨床。

5、CAR-T 療法

工程T細(xì)胞正在成為強(qiáng)有力的癌癥工具（CAR-T細(xì)胞治療如圖3所示）。嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptors，CARs)是人工合成的基因工程受體，抗原，在一個單一的分子中整合了T淋巴細(xì)胞的特異性、功能和代謝[17,18]。CAR由抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，來自于一個免疫球蛋白分子或一個T細(xì)胞受體，融合為一個細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)激活和共刺激以增強(qiáng)T細(xì)胞功能和持久性。與抗原的生理受體不同，CARs可以被工程化設(shè)計，識別蛋白質(zhì)和碳水化合物的糖脂，以及HLA多肽復(fù)合物。CAR-T細(xì)胞療法，全稱Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，是一種細(xì)胞治療方法，它是在T細(xì)胞上加上一個“嵌合抗原受體”，“嵌合抗原受體”由“GPS導(dǎo)航”（胞外抗原識別區(qū)）和“激活按鈕”（胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)）組成， 而CTL019或者說CAR-T 019，實際就是加上了一個可以識別腫瘤細(xì)胞表面“CD19”的一個抗原受體，當(dāng)“GPS導(dǎo)航”定位到腫瘤抗原并與之結(jié)合，之后“激活按鈕”就開始激活T細(xì)胞，從而對腫瘤展開殺戒。說白了，就是給我們自己的“軍隊”加上一個可以精準(zhǔn)識別“敵人”的“大殺器”，這批經(jīng)過“改造”后的“特種部隊”回輸?shù)饺梭w后，就可以毫不費力地找到帶有特殊標(biāo)記的“敵人”，并將之全部剿滅。

來源：Science

CD19 CARs在難治性ALL和難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）臨床受益，2017 年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)兩個基因工程細(xì)胞的產(chǎn)品，是美國首次批準(zhǔn)。目前的研究目標(biāo)是將CAR治療擴(kuò)大到髓系惡性腫瘤和實體瘤。這些疾病帶來了挑戰(zhàn)，因為可靠的腫瘤特異性細(xì)胞表面抗原尚未得到驗證。此外，需要一個方法，有助于CAR-T細(xì)胞進(jìn)入較大腫瘤或免疫特權(quán)區(qū)域，克服腫瘤微環(huán)境信號。通用第三方CAR-T細(xì)胞，可以使用“現(xiàn)成的”CAR-T細(xì)胞，與患者的自身特異性T細(xì)胞相比，將提供更快速和更便宜的治療。T細(xì)胞缺乏內(nèi)源性T細(xì)胞受體和/或主要組織相容性復(fù)合體分子，以減少GVHD和排斥的風(fēng)險，在臨床前或早期臨床研究，作為邁向這一目標(biāo)的第一步。CAR-T細(xì)胞已經(jīng)對某些癌癥治療具有很大的影響，這一成功為未來T細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療其他癌癥和其他疾病如自身免疫性疾病和艾滋病的治療提供了基礎(chǔ)。

6、結(jié) 論

經(jīng)過二三十年的失敗、探索、再失敗、再探索的螺旋式進(jìn)展，基因治療開始進(jìn)入高速發(fā)展的階段，其安全性和有效性開始得到醫(yī)藥監(jiān)管部門和醫(yī)藥巨頭的認(rèn)可。世界范圍內(nèi)，制藥巨頭葛蘭素史克、諾華、輝瑞、賽諾菲等紛紛通過收購或合作進(jìn)入基因治療領(lǐng)域，投入基因治療藥物上市前最后階段的推動中。傳統(tǒng)制藥巨頭的參與極大地推動了基因治療臨床試驗的開展，基因治療公司開始成為納斯達(dá)克投資人的寵兒。然而，未來仍有很多挑戰(zhàn)，包括解決整合基因載體的遺傳毒性或關(guān)閉靶向基因組編輯，提高基因轉(zhuǎn)移水平或基因組編輯效率，解決體內(nèi)對載體的免疫反應(yīng)，并對如基因組編輯的倫理爭議和昂貴的治療費用等問題達(dá)成社會共識等。

基因治療將是醫(yī)學(xué)史上的一次革命，因為人自己、甚至人的疾病組織(如腫瘤)本身成為“基因工程的藥廠”，生長出的藥物(基因產(chǎn)物)治療人的疾病。但是，關(guān)鍵問題是何時才能實現(xiàn)。

盡管目前對于基因治療還有許多技術(shù)難題有待解決，但可以相信：隨著人類基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的闡明，以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因方法的完善，基因治療必將成為21世紀(jì)人類攻克疑難病癥的一種常規(guī)治療手段。

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