根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計，在10月8日-10月10日3天時間里，全球COVID-19新確診患者數(shù)目就增加了100萬人。隨著北半球秋冬季的到來，控制COVID-19疫情仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)?？焖?、準確的核酸檢測能夠幫助醫(yī)務(wù)工作者更早發(fā)現(xiàn)受到新冠病毒感染的患者，從而對他們進行治療/隔離和接觸者追蹤。目前的大部分核酸檢測仍然需要將樣本送到專門的實驗室進行處理，往往需要一天，甚至更長時間才能獲得結(jié)果，從而可能延誤對患者進行治療和隔離的時間。

因此，科研人員一致在努力開發(fā)更快速、更簡便的核酸檢測。使用CRISPR技術(shù)加快檢測速度是其中的一個方向。藥明康德內(nèi)容團隊此前也報道過著名學(xué)者張鋒博士率領(lǐng)的團隊和他的合作者們利用CRISPR技術(shù)開發(fā)簡易新冠病毒檢測的努力。為了讓檢測更為快速、簡便，張鋒團隊的STOPCovid檢測已經(jīng)經(jīng)過不斷迭代，不但使用恒溫PCR代替了傳統(tǒng)PCR，而且刪減了純化RNA的過程，還通過優(yōu)化步驟提高了檢測的靈敏度。

日前，今年諾貝爾化學(xué)獎得主之一Jennifer Doudna博士率領(lǐng)的團隊和她的合作伙伴在預(yù)印本網(wǎng)站medRxiv上發(fā)布了一篇論文，基于CRISPR-Cas13a技術(shù)開發(fā)了一種新型新冠病毒檢測。這款檢測與眾不同之處在于它不需要對病毒RNA使用RT-PCR進行擴增，可以直接定量檢測樣本中的病毒RNA水平。研究人員還開發(fā)了一款基于智能手機相機的檢測系統(tǒng)，讓醫(yī)務(wù)人員不需要復(fù)雜的儀器，就可以在實驗室以外的環(huán)境中讀出檢測結(jié)果。

不用PCR，提高CRISPR檢測的靈敏度

這一檢測的核心原理并不難理解。研究人員使用一種叫做Cas13a的酶和與之相結(jié)合的CRISPR RNA（crRNA）構(gòu)成一個復(fù)合體。當crRNA與病毒RNA上的特異性序列相結(jié)合之后，能夠激活Cas13a酶。Cas13a是一種很有趣的酶，一旦被激活，它就會不分青紅皂白地切開周圍所遇到的任何其他單鏈RNA分子。利用這種特性，研究人員們在樣本里還會添加一種通過RNA相連接的熒光分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會被切斷，釋放出能夠發(fā)出熒光的熒光分子。這樣通過讀取熒光信號，就可以檢測到病毒特異性序列的存在。

以前基于這一原理的CRISPR檢測為了提高檢測的靈敏度，都要對樣本中的RNA通過PCR進行擴增。然而這一PCR步驟不但增加了檢測所需的時間，也意味著檢測數(shù)量會受到PCR試劑供給的限制。

▲使用多個靶向不同病毒序列的crRNA能夠提高檢測靈敏度（圖片來源：參考資料[2]）

在這項研究中，研究人員采用了另一種方法提高檢測的靈敏度。他們推測，既然一個跟病毒特異性序列結(jié)合的crRNA能夠激活Cas13a酶的活性，那么兩個跟不同病毒特異性序列結(jié)合的crRNA是否就能更快地激活Cas13a酶的活性，讓熒光信號的上升速度變得更快呢？

實驗也證實了他們的假設(shè)。當研究人員使用兩種不同的crRNA激活Cas13a酶時，雖然總共的crRNA水平?jīng)]有變，但是熒光信號的增長速度明顯提高了。通過檢測熒光信號的增長速度而不是熒光信號的絕對值，他們發(fā)現(xiàn)使用兩個crRNA能夠顯著提高檢測的靈敏度。當使用一個crRNA時，檢測的靈敏度達到10，000個病毒拷貝/微升，而使用兩個不同crRNA時，靈敏度提高到低于1000拷貝/微升。

為了進一步提高檢測的靈敏度，研究人員開發(fā)了包含3個靶向新冠病毒不同特異性RNA序列的crRNA的檢測手段，在檢測5個COVID-19患者鼻咽拭子樣本的實驗中，這一檢測準確地發(fā)現(xiàn)了這5個陽性樣本，而且熒光信號增加的速度與輸入樣本中的病毒拷貝數(shù)有很好的線性關(guān)系，進一步證明這一檢測可以用于定量測量病毒水平。

利用智能手機的相機構(gòu)建簡易信號讀取系統(tǒng)

為了證明這一簡易檢測能夠在實驗室以外的環(huán)境中使用，研究人員基于智能手機的相機構(gòu)建了一個簡易的熒光信號檢測系統(tǒng)。令他們意外的是，這個基于手機相機的熒光信號檢測系統(tǒng)的靈敏度竟然比實驗室里使用的商業(yè)化讀板器（plate reader）高出一個數(shù)量級。使用這款簡易熒光信號檢測系統(tǒng)，研究人員只需5分鐘就能判斷出5位COVID-19患者的鼻咽拭子樣本為陽性。

▲基于智能手機相機設(shè)計的熒光信號讀取系統(tǒng)（圖片來源：參考資料[2]）

研究人員在討論部分指出，如今智能手機不但很普及，而且它們的相機靈敏度都很高。更重要的是智能手機通常都攜帶GPS并且可以聯(lián)網(wǎng)。這讓將讀取的結(jié)果傳輸?shù)皆贫藬?shù)據(jù)庫，協(xié)助接觸者追蹤變得更為簡便。基于智能手機的新冠病毒檢測系統(tǒng)可能在控制目前和未來的大流行方面起到重要的作用。

參考資料：

[1] New test detects coronavirus in just 5 minutes. Retrieved October 12, 2020, from https://www.sciencemag.org/news/2020/10/new-test-detects-coronavirus-just-5-minutes

[2] Fozouni et al., Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone. medRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947